日本医科大学 病理学講座　統御機構・腫瘍学　Integrative Oncological Pathology

免疫蛍光染色(immunofluorescent analysis)は数種類のタンパク質の局在を一度に観察できる方法として広く用いられており、その観察には共焦点顕微鏡が有用である。
共焦点レーザー顕微鏡は、レーザー光を用いて「共焦点方式」という方式で2次元走査を行い、細胞、組織面からの反射や散乱光を光検出器で検出するものである。「共焦点」とは、光源の一点から出た光が検出器の一点に集まる状態をいう。通常の光学顕微鏡では、観察したい焦点とさらにその上下方向からの光も含まれるため、観察像が不鮮明となるが、 共焦点レーザー顕微鏡では、検出器の前にピンホールが設置されており、焦点位置からのみの散乱光を選択し不鮮明な像の原因となる上下方向からの光を遮断することができる。さらに厚さのある細胞、組織等について、様々な深度でレーザーにてXY方向にスキャンし，1枚の2次元画像が得られる。次にZ方向に深度を変えて断層像を順次に撮影し、画像解析ソフトで重ね合わせることで、 三次元画像（細胞、組織の立体像）を構築することができる。これにより，細胞や組織の構造や物質の局在などを非破壊的・3次元的に観察することができる。

2．ライブセルイメージングによる細胞の運動能、増殖能の解析
細胞を生きたまま、通常の培養環境と同じ状況で観察することは、固定された細胞とは異なった情報を提供してくれる。細胞を、37℃、5％CO2の培養環境下で、5分毎など定期的に撮影する。これにより、細胞の増殖の変化や、運動性の変化についてリアルタイムに観察することが可能である。さらに、連続撮影された画像をもとに、数個の細胞を指定しそれらの平面的な動きの軌跡をソフトウエアで解析することにより、細胞の移動距離を計測する。蛍光標識を行った細胞を用い、目的タンパク質の局在の変化を生きたまま、リアルタイムに観察することも可能である。